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26 de febrero de 1996

Diario Oficial

NORMA Oficial Mexicana NOM-032-ZOO-1996, Determinación de antibióticos en hígado, músculo y riñón 
de bovinos, ovinos, equinos, porcinos, aves, caprinos y cérvidos por la prueba de la torunda y por 
bioensayo. 


Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de Agricultura, 
Ganadería y Desarrollo Rural. 
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-032-ZOO-1996, DETERMINACION DE ANTIBIOTICOS EN HIGADO, 
MUSCULO Y RIÑON DE BOVINOS, OVINOS, EQUINOS, PORCINOS, AVES, CAPRINOS Y CERVIDOS POR LA 
PRUEBA DE LA TORUNDA Y POR BIOENSAYO. 
La Secretaría de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural, por conducto de la Dirección General Jurídica, con 
fundamento en los artículos 1o., 3o., 4o. fracción III, 12, 13, 16, 21, 22, 31 y 32 de la Ley Federal de Sanidad 
Animal; 38 fracción II, 40, 41, 43 y 47 fracción IV de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 35 fracción 
IV de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federal; 10 fracción V del Reglamento Interior de la Secretaría 
de Agricultura, y Recursos Hidráulicos, y 
CONSIDERANDO 
Que la determinación de antibióticos en hígado, músculo y riñón de bovinos, ovinos, equinos, porcinos, aves, 
caprinos y cérvidos por la prueba de la torunda y por bioensayo, se establece con el fin de asegurar que el 
suministro de alimentos a los consumidores, no rebasen los límites máximos permisibles de este tipo de residuos. 
Que el consumo de alimentos con residuos de antibióticos implica diversos riesgos para la salud. 
Que entre los beneficios que reporta el determinar este tipo de residuos, se encuentra el de participar con 
mayor confianza en el comercio internacional de alimentos, contando de esta forma con las bases suficientes para 
certificar la inocuidad de los productos alimenticios cárnicos, tanto importados como exportados. 
Que para alcanzar los objetivos señalados en los párrafos anteriores, con fecha 13 de septiembre de 1995, se 
publicó en el Diario Oficial de la Federación el Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM-035-ZOO-1995, 
Determinación de antibióticos en hígado, músculo y riñón de bovinos, ovinos, equinos, porcinos, aves, caprinos y 
cérvidos por la prueba de la torunda y por bioensayo. 
Que en virtud de que dentro del término de 90 días a que se refiere la fracción I, del artículo 47 de la Ley 
Federal sobre Metrología y Normalización, no se presentaron comentarios al proyecto, las disposiciones del mismo 
han resultado procedentes en sus términos. 
Que por todo lo anterior y con el objeto de mantener el orden cronológico en la clave de las normas en esta 
materia, he tenido a bien expedir la NOM-032-ZOO-1996, DETERMINACION DE ANTIBIOTICOS EN HIGADO, 
MUSCULO Y RIÑON DE BOVINOS, OVINOS, EQUINOS, PORCINOS, AVES, CAPRINOS Y CERVIDOS POR LA 
PRUEBA DE LA TORUNDA Y POR BIOENSAYO. 
INDICE 
 1.	OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACION 
 2.	REFERENCIAS 
 3.	DEFINICIONES 
 4.	SIMBOLOS Y ABREVIATURAS 
 5.	FUNDAMENTO 
 6.	MATERIAL Y EQUIPO 
 7.	REACTIVOS Y SOLUCIONES 
 8.	MICROORGANISMOS DE PRUEBA 
 9.	PROCEDIMIENTO 
10.	RESULTADOS 
11.	SANCIONES 
12.	CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES 
13.	BIBLIOGRAFIA 
14.	DISPOSICIONES TRANSITORIAS 
"APENDICE A" (NORMATIVO) 
"APENDICE B" (NORMATIVO) 
1. Objetivo y campo de aplicación 
1.1. Objetivo. 
Esta Norma Oficial Mexicana establece el método de prueba, para la determinación de antibióticos en hígado, 
músculo y riñón de bovinos, ovinos, equinos, porcinos, aves, caprinos y cérvidos. 
1.2. Campo de aplicación. 
Esta Norma se aplica a los laboratorios de análisis de residuos tóxicos en tejidos alimenticios primarios de 
origen animal, aprobados por la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural. 
1.3. La vigilancia de esta Norma corresponde a la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural, así 
como a los gobiernos de los estados en el ámbito de sus respectivas competencias y circunscripciones territoriales, 
de conformidad con los acuerdos de coordinación respectivos. 
1.4. La aplicación de las disposiciones previstas en esta Norma, compete a la Dirección General de Salud 
Animal, así como a las delegaciones estatales de la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural, en el 
ámbito de su respectiva competencia y circunscripciones territoriales. 
2. Referencias 
Para la correcta aplicación de esta Norma, deben consultarse las siguientes normas oficiales mexicanas: 
NOM-003-ZOO-1994, Criterios para la Operación de Laboratorios de Pruebas Aprobados en Materia 
Zoosanitaria, publicada el 28 de abril de 1994. 
NOM-004-ZOO-1994, Control de Residuos Tóxicos en Carne, Grasa, Hígado y Riñón de Bovinos, Equinos, 
Porcinos y Ovinos, publicada el 11 de agosto de 1994. 
NOM-008-SCFI-1993, Norma Oficial Mexicana, Sistema General de Unidades de Medida, publicada el 14 de 
octubre de 1993. 
3. Definiciones 
Cilindros o penicilindros: Estructuras tubulares de acero inoxidable con 10 mm de altura, 6 mm de diámetro 
interno, 8 mm de diámetro externo y 300 µl de capacidad. 
Halo de inhibición: Es la zona dentro del medio de cultivo, en que se observa ausencia del crecimiento del 
microorganismo de prueba. 
Microorganismo de prueba: Es una cepa tipificada con ciertas características metabólicas, que al ser 
inoculado en un medio de cultivo y desafiado contra un antibiótico específico, deriva en susceptibilidad a ese 
antibiótico. 
Nivel de inóculo: Es aquella concentración de la suspensión de esporas en la cual se observa un halo o zona 
de inhibición uniforme. 
Sensidisco: Disco de papel filtro de poro grueso del número 4, de 7 mm de diámetro, impregnado con el 
antibiótico de prueba. 
Solución patrón o de referencia: Es aquella con una concentración conocida de antibiótico. 
Suspensión de esporas: Es aquella que contiene una concentración conocida de los microorganismos de 
prueba en forma latente. 
4. Símbolos y abreviaturas 
cm	centímetro 
ºC	grados Celcius o centígrados 
GR	grado reactivo 
g	gramo 
h	hora 
M	Molar 
m	metro 
mg	miligramo 
min	minuto 
ml	mililitro 
mm	milímetro 
N	normal 
µg	microgramo 
µl	microlitro 
ppm	partes por millón 
%	por ciento 
rpm	revoluciones por minuto 
Sol	solución 
UFC	unidades formadoras de colonias 
5. Fundamento 
La técnica se basa en la difusión del antibiótico desde una torunda o hisopo (prueba preliminar) o un cilindro 
vertical (prueba confirmatoria), que contiene un extracto del tejido a analizar, sobre una capa de agar solidificada, 
con una concentración conocida de una suspensión de esporas de un germen de prueba susceptible, depositada 
sobre una capa de medio de cultivo específico en una caja de Petri e incubada durante 24 horas a 37 ºC, para 
determinar la presencia de antibióticos por la formación de un halo de inhibición alrededor de la torunda o cilindro. 
6. Material y equipo 
6.1. Material: 
-	Algodón 
-	Botellas Roux 
-	Cajas de Petri de 25 x 100 mm 
-	Cilindros o penicilindros de acero inoxidable 
-	Gasas 
-	Marcador de tinta indeleble 
-	Matraces volumétricos clase A de 10, 25, 50, 100 y 1000 ml 
-	Matraces Erlenmeyer de 50, 250, 500 y 1000 ml 
-	Micropipeta de 1000 µl 
-	Papel semilogarítmico de 2 ciclos 
-	Perlas de vidrio 
-	Pinzas de disección 
-	Pipetas graduadas de diferentes volúmenes 
-	Pipetas volumétricas clase A de 1, 5 y 10 ml 
-	Pipeteador 
-	Puntas para micropipeta 
-	Sensidiscos impregnados con estreptomicina 
-	Torundas de algodón 
-	Tubos de centrífuga de polipropileno de 50 ml 
6.2. Equipo: 
-	Agitador mecánico 
-	Autoclave 
-	Balanza analítica 
-	Balanza granataria 
-	Centrífuga 
-	Colocador de penicilindros 
-	Incubadora 35 ± 1 ºC 
-	Medidor de halos 
-	Platina con agitador 
-	Potenciómetro o pH metro 
7. Reactivos y soluciones 
7.1. Reactivos: 
-	Acido clorhídrico (HCl) 
-	Agar nutritivo 
-	Cloruro de sodio (NaCl) 
-	Estándares certificados de los siguientes antibióticos: estreptomicina, eritromicina, neomicina, penicilina G 
sódica y tretraciclina. 
-	Fosfato de potasio dibásico GR 
-	Fosfato de potasio monobásico GR 
-	Hidróxido de sodio (NaOH) 
-	Medio para antibióticos No. 1 
-	Medio para antibióticos No. 2 
-	Medio para antibióticos No. 5 
-	Medio para antibióticos No. 8 
-	Medio para antibióticos No. 11 
-	Metanol (MeOH) 
-	Sulfato de manganeso monohidratado (MnSO4H2O) 
7.2. Soluciones: 
-	Solución amortiguadora de fosfatos al 1% pH 6.0 ± 0.1: 
Disolver 8 g de fosfato de potasio monobásico y 2 g de fosfato de potasio dibásico en agua destilada y diluir a 
1000 ml con la misma. 
-	Solución amortiguadora de fosfatos 0.1 M pH 8 ± 0.1: 
Disolver 16.73 g de fosfato de potasio dibásico, 0.523 g de fosfato de potasio monobásico en agua destilada y 
diluir a 1000 ml con la misma. 
-	Solución amortiguadora de fosfatos 0.1 M pH 4.5 ± 0.1: 
Disolver 13.6 g de fosfato de potasio monobásico en agua destilada y diluir a 1000 ml con la misma. 
-	Solución amortiguadora al 10% pH 6.0 ± 0.1: 
Disolver 80 g de fosfato de potasio monobásico y 20 g de dibásico en agua destilada y diluir a 1000 ml con la 
misma. 
-	Solución amortiguadora de fosfatos 0.2 M pH 8.0 ± 0.1: 
Disolver 33.46 g de fosfato de potasio dibásico y 1.046 g de fosfato de potasio monobásico en agua destilada y 
diluir a 1000 ml con la misma. 
Nota: Para la preparación de cualquiera de las soluciones amortiguadoras anteriores, ajustar el pH utilizando 
ácido clorhídrico o hidróxido de sodio, antes de aforar, según sea el caso. 
-	Acido clorhídrico (HCl) 0.01 N. Disolver 0.85 ml de ácido clorhídrico concentrado en 1000 ml de agua 
destilada. 
-	Acido clorhídrico (HCl) 0.1 N. Disolver 8.5 ml de ácido clorhídrico concentrado en 1000 ml de agua 
destilada. 
-	Hidróxido de sodio (NaOH) 1.0 N. Disolver 40 g de hidróxido de sodio en 100 ml de agua destilada y 
aforar con la misma a 1000 ml. 
-	Solución estéril de cloruro de sodio (NaCl) 0.85%. Disolver 0.85 g de cloruro de sodio en 100 ml de agua 
destilada. 
-	Penicilinasa. 
8. Microorganismos de prueba 
-	Sarcina lutea ATCC 9341a, susceptible a penicilina y eritromicina y resistente a estreptomicina y 
neomicina. 
-	Bacillus cereus variedad mycoides ATCC 11778 susceptible a tetraciclina. 
-	Bacillus subtilis ATCC 6633, susceptible a estreptomicina. 
-	Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, susceptible a neomicina, resistente a tetraciclina. 
-	Sarcina lutea ATCC 15957, resistente a eritromicina. 
9. Procedimiento 
9.1. Prueba de la torunda (Preliminar) 
9.1.1. Preparación de la suspensión bacteriana Bacillus subtilis ATCC 6633 
Siembras.- A partir de un tubo de cultivo con agar nutritivo en forma inclinada que contenga la cepa de prueba 
e incubado durante 24 h a 35 ± 1 ºC, realizar un lavado con aproximadamente 2-3 ml de solución salina. Inocular 
una botella Roux conteniendo 250 ml de agar para antibióticos número 1, con 300 mg de sulfato de manganeso 
monohidratado (MnSO4H2O) por litro de medio, ayudándose con solución salina fisiológica y perlas de vidrio 
estériles, hasta cubrir totalmente la superficie del medio. Incubar durante 18-24 h a 35 ± 1 ºC. 
Cosecha.- Resuspender el paquete con solución salina estéril y pasarlo a un tubo de centrífuga. Lavar 3 veces 
como mínimo el paquete celular con solución salina estéril hasta eliminar el medio de cultivo residual, separándolo 
por centrifugación y decantación, al final reconstituir el sedimento, resuspenderlo con 50 ml de solución salina 
estéril y calentar la suspensión durante 30 min en baño maría a 70 ºC para favorecer la esporulación. 
Ajuste.- Se efectúa por cuenta microbiológica utilizando el método de vaciado en placa; dependiendo de la 
concentración deben efectuarse las diluciones respectivas para obtener concentraciones finales de 1 x 10-5, 2 x 10-
5, 3 x 10-5 UFC/ml. 
Determinación del nivel de inóculo.- En cajas de Petri estériles de 25 x 100 mm, colocar 20 ml de medio 
para antibióticos número 5 como capa base. Dejar solidificar la capa a temperatura de 35 ºC. 
Sobre la capa base distribuir 5 ml de agar para antibióticos número 5 que contenga la suspensión de esporas 
en concentraciones de 1 x 10-5, 2 x 10-5 y 3 x 10-5 UFC/ml, como capa semilla y dejar solidificar a temperatura 
ambiente. 
Colocar seis sensidiscos impregnados de tal manera que se asegure contengan estreptomicina a las 
concentraciones siguientes: tres a la concentración mínima inhibitoria y tres a su valor inmediato superior, sobre la 
capa de agar (0.25 y 0.50 µg/ml), el volumen utilizado para impregnar los discos dependerá de la concentración de 
la solución utilizada para tal fin. Los sensidiscos impregnados también pueden ser adquiridos comercialmente. 
Para el nivel de inóculo óptimo, tomar aquella concentración de esporas en la cual se observe un halo de 
inhibición más uniforme. 
9.1.2. Método de la torunda. 
- En cajas de Petri estériles de 25 x 100 mm, colocar 10 ml de medio para antibióticos número 5 como capa 
base. 
- Dejar solidificar la capa base a una temperatura de aproximadamente 35 ºC. 
- Sobre la capa base colocar 4 ml de agar para antibióticos número 5, que contenga una suspensión de 
esporas de concentración conocida como capa semilla determinada por el nivel de inóculo óptimo. 
- Dejar solidificar la capa semilla. 
- Para la inoculación de placas se deja descongelar totalmente la muestra de tejido de hígado, riñón y/o 
músculo. 
- Impregnar las torundas con la muestra por analizar, haciéndolos penetrar en forma giratoria en el tejido, al 
que previamente se le ha hecho una incisión. 
- Dejar la torunda en la muestra aproximadamente una hora, removiéndola cada 15 min aproximadamente. 
- Una vez impregnadas las torundas, colocarlas en una caja de Petri que contenga una concentración 
apropiada de esporas, previamente preparada y colocar un sensidisco de 5 µg de estreptomicina como control. 
- Incubar las cajas inoculadas a 35 ± 1 ºC durante 24 h. 
9.2. Bioensayo. 
9.2.1. Procedimientos y consideraciones generales. 
Este es un método confirmatorio, que permite conocer el tipo y concentración de los antibióticos detectados por 
el método preliminar de la torunda. 
9.2.1.1. Estándares o patrones de referencia de trabajo. 
Seguir las instrucciones del fabricante para la preparación y almacenamiento de los patrones de referencia. 
Preparar la solución patrón o madre, pesando cuidadosamente una pequeña cantidad del patrón de referencia y 
disolver el polvo pesado en el diluente adecuado, para obtener una solución de una concentración conveniente. 
9.2.1.2. Curva estándar o patrón de referencia. 
Preparar una curva estándar o patrón de referencia con tejido libre de antibiótico, comparable a aquel bajo 
prueba. Diluir el tejido de control descrito por el método particular y probar esta dilución sobre placas apropiadas 
para asegurar que no se presenta ninguna zona de inhibición. Preparar la curva estándar o normalizada 
simultáneamente con la solución de prueba. Efectuar diluciones de la solución patrón o madre, descrita para cada 
antibiótico. Utilizar la concentración indicada como la de referencia. Preparar placas con la capa de agar base y la 
capa semilla apropiada, descrita para cada antibiótico. Permitir que el medio solidifique sobre una superficie 
nivelada y plana. Colocar las placas para bioensayo sobre cada caja de Petri. Llenar alternadamente tres cilindros 
con la concentración de referencia como se indica en el ("Apéndice A" Normativo) y los otros tres con cada una de 
las otras concentraciones del patrón de referencia. Usar tres placas para cada concentración requerida en la curva 
estándar, excepto para el de referencia, para un total de 12 placas. Incubar las placas toda la noche a 37 ºC y 
medir los diámetros de las zonas de inhibición. 
Para cada serie de tres placas, obtener el promedio de las nueve lecturas de las de referencia y de las de 
prueba. El promedio de las 36 lecturas de las concentraciones de referencia de las 12 placas es el punto de 
corrección para la curva. Corregir el valor promedio obtenido para cada concentración, efectuar los cálculos 
apropiados, si la lectura de la concentración de referencia de la serie de tres placas es la misma que la del punto 
de corrección, pero si no en la corrección de la segunda concentración de la curva estándar, el promedio de las 36 
lecturas de la concentración de referencia fuera de 20 mm y el promedio de las nueve lecturas de la concentración 
de referencia de esta serie de tres placas fuera de 19.8 mm, la corrección es de + 0.2 mm. Si el promedio de la 
segunda concentración en las mismas tres placas es de 17.0 mm, el valor corregido es de 17.2 mm. Para el 
vaciado de datos se recomienda usar un formato similar al del ("Apéndice B" Normativo). Grafique los valores 
corregidos incluyendo el punto de corrección en papel semilogarítmico de dos ciclos, utilizando la escala 
logarítmica para la concentración y la escala aritmética para los diámetros de la zonas. Dibujar una línea por 
medio de la utilización de las siguientes ecuaciones: 
L = (3a + 2b + c - e) / 5 
H = (3e + 2d + c - a) / 5 
Donde: 
L y H es igual a los diámetros de zona calculados para las concentraciones baja y alta respectivamente, sobre 
la línea de respuesta del estándar; a, b, c, d y e, es igual al promedio del diámetro de las lecturas corregidas para 
cada concentración sobre la línea de respuesta donde "a" es igual a la concentración más baja del antibiótico 
utilizado; y "e" equivale a la más alta. 
9.2.1.3. Determinación y cálculos de potencia. 
Para calcular el contenido de antibiótico de la muestra, promediar las lecturas de las zonas del estándar y las 
lecturas de las zonas de la muestra sobre las tres placas; esta última da un tamaño de zona promedio más grande 
que el promedio del estándar, sumar la diferencia entre ellas al tamaño de la zona de referencia sobre la curva, 
conforme al anterior punto 9.2.1.2. Si el promedio del valor de la muestra es más pequeño que el valor del 
estándar, restar la diferencia entre ellas al tamaño de la zona de referencia sobre la curva. De la gráfica leer la 
concentración correspondiente al tamaño de la zona ajustada de la muestra. Tomar las diluciones en consideración 
en el cálculo de la potencia final de esta última. En casos donde los estándares son preparados en una forma que 
difiere de aquella de la muestra, proceda a experimentos de recuperación. 
9.2.1.4. Experimentos de recuperación. 
Utilizar muestras de control del producto para ser probado, preparar varias muestras a las cuales se les ha 
adicionado cantidades controladas y variables del antibiótico. Las concentraciones escogidas deberán caer en el 
rango de la curva estándar. Efectuar el procedimiento de extracción para esas muestras en paralelo con las no 
conocidas. Determinar la recuperación promedio del antibiótico adicionado y utilizar el factor de corrección en el 
cálculo de la potencia del antibiótico para las muestras no conocidas. 
9.2.1.5. Controles. 
Es esencial que cualquier actividad antibiótica detectada, provenga de la muestra y no del medio ambiente. 
Siempre se deben incluir controles negativos para indicar el grado de precisión y exactitud de las determinaciones 
a ser reportadas. Los tejidos pueden tener efectos inhibitorios por sí mismos y si es así, la sensibilidad del método 
es aquella cantidad de antibiótico que produce una respuesta significativamente mayor que la del tejido por sí 
mismo. 
9.2.2. Preparación de las muestras. 
Mezclar 10 g del tejido de la muestra con 40 ml de la solución amortiguadora apropiada por un min. Debido a la 
inhibición natural de algunos tejidos, es quizá necesario usar una dilución más alta. Permitir que la muestra se 
extraiga por un mínimo de 45 min. Desecar y filtrar la porción clara del extracto. Alternativamente puede molerse el 
tejido de la muestra, pesar 10 g en tubos de vidrio de 250 x 175 mm adicionar 40 ml de la solución amortiguadora 
adecuada. Continuar mezclando, la filtración no es necesaria a menos que el extracto no esté claro. 
9.2.3. Método del análisis de penicilina. 
Mantener el organismo de prueba Sarcina lutea (ATCC 9341a), como un cultivo patrón o madre, sobre agar 
inclinado de medio número 1, resembrar aproximadamente cada dos semanas. Preparar la suspensión como 
sigue: 
Sembrar en forma de estría en un tubo de agar inclinado, el organismo de prueba e incubar por 18-24 horas a 
35 ± 1 ºC. Lavar el crecimiento con 2-3 ml de solución salina fisiológica estéril y transferir a la superficie seca de 
una botella Roux que contenga 250 ml de medio número 1. Difundir la suspensión uniformemente sobre la 
superficie entera con la ayuda de perlas de vidrio estériles. Incubar por 18-24 horas a 35 ± 1 ºC. 
Lavar el crecimiento de la superficie del agar con 50 ml de solución salina estéril. Si una alícuota de esta 
suspensión se diluye 1:35 y da una transmitancia del 25%, la suspensión es satisfactoria para su uso. Puede ser 
necesario ajustar la suspensión por dilución, así que una alícuota de la suspensión ajustada cuando se diluye 1:35 
dará la transmitancia deseada del 25%. 
Nota: Usar únicamente la suspensión ajustada y no la dilución 1:35 para preparar la capa semilla. 
9.2.3.1. Nivel de inóculo. 
Antes del análisis, determinar por placas de prueba la cantidad óptima de la suspensión para adicionar a la 
capa semilla para obtener las mejores zonas de inhibición. 
Probar cada suspensión de bacterias para determinar la inoculación óptima. Preparar placas usando varios 
niveles de suspensión, por ejemplo 0.1, 0.2, 0.5, y 1.0 ml en 100 ml de la capa semilla fundida, la experiencia 
dictará si todos aquellos niveles son necesarios para verificar cada nueva suspensión. Elija un nivel de inóculo que 
dé la mejor sensibilidad y una zona clara de inhibición con la dilución de referencia. 
9.2.3.2. Preparación de placas. 
Distribuir uniformemente 20 ml de medio número 1 en cajas de Petri y dejar solidificar en una superficie plana y 
nivelada, que es la capa base. Adicionar el nivel de inóculo apropiado en cada 100 ml de medio para antibióticos 
número 2 a 49 ºC. Mezclar completamente y adicionar 4.0 ml de este agar inoculado a cada placa conteniendo 
medio número 1 solidificado. Distribuir el agar uniformemente inclinando las placas de lado a lado por medio de un 
movimiento circular. Dejar solidificar la capa semilla y usar las placas el mismo día de su preparación. Perforar y 
llenar las placas para las preparaciones de la curva estándar y muestra. Usar la solución amortiguadora pH 6.0 en 
la preparación de la muestra, incubar a 30 ± 1 ºC. 
9.2.3.3. Solución patrón o madre. 
Pesar exactamente cerca de 10 mg de penicilina G sódica USP referencia estándar, pueden pesarse varios al 
mismo tiempo en viales de vidrio tapados y conservarlos en un desecador. Disolver por descargo de matraz 
Erlenmeyer de 250 a 300 ml con tapón de vidrio, en suficiente solución amortiguadora pH 6.0 para dar una 
concentración de exactamente 1000 unidades por ml (U/ml). Almacenar en refrigerador y conservar por no más de 
2 días antes de utilizarlo. Calcular la cantidad de solución amortiguadora a adicionar por medio de la siguiente 
fórmula: 
La potencia de penicilina x mg	=	ml de solución de unidades deseadas	
	amortiguadora añadida 
9.2.3.4. Curva estándar o patrón de referencia. 
En matraces volumétricos y utilizando solución amortiguadora pH 6.0 preparar soluciones de trabajo a partir de 
la solución patrón o madre, para dar concentraciones de 0.05, 0.1 y 0.2 U/ml. La concentración de 0.05 U/ml es la 
concentración de referencia. Se sugiere usar el método de dilución siguiente: 
De 
(U/ml)
Tome 
(ml)
Diluya en matraz volumétrico
Concentración 
resultante(U/ml)

1000
2.5
50
50.0

50
2.5
50
2.5

2.5
2.0
25
0.2

2.5
2.0
50
0.1

2.5
1.0
50
0.05

2.5
0.5
50
0.025

2.5
0.5
100
0.0125

9.2.3.5. Preparación de la muestra. 
Pesar exactamente 10 g de la muestra y mezclar con la cantidad apropiada de solución amortiguadora, como 
se indica en el "Apéndice A" (Normativo). Realizar la preparación como se detalla en el punto 9.2.2. 
9.2.3.6. Determinación. 
Usar tres placas para cada solución de prueba. Colocar los cilindros para bioensayo sobre las placas de 
incubación, utilizar tres para cada muestra a ser analizada. Llenar tres cilindros alternados en cada uno, con 0.05 
U/ml del estándar de penicilina (referencia) y los remanentes con la muestra bajo prueba. Colocar las tapas sobre 
las placas e incubar a 30 ºC de 16 a 18 h. 
Después de la incubación, invertir las placas para quitar los cilindros y medir el diámetro de cada zona de 
inhibición. Para identificar la actividad como penicilina, añadir penicilinasa concentrada a razón de 0.5 ml por cada 
10 ml de extracto de la muestra e incubar 30 min a 35 ± 1 ºC. Sobre una placa adicional, llenar dos cilindros con 
estándar 0.5 U/ml, dos cilindros con la muestra no tratada y dos con la tratada con penicilinasa. Incubar la placa 
de 16-18 h a 30 ºC. 
Una zona de inhibición con la muestra tratada y ninguna zona o una zona grandemente reducida con la 
muestra tratada con penicilinasa, es traducida como una prueba positiva para penicilina. 
9.2.3.7. Cálculo de potencia. 
Proceda como se describe en el punto 9.2.1.3. 
9.2.4. Procedimiento del análisis de tetraciclina. 
9.2.4.1. Preparación de la suspensión de esporas. 
El organismo de prueba es Bacillus cereus variedad mycoides, ATCC 11778, crece a 30 ºC y se mantiene en el 
refrigerador sobre medio antibiótico número 8. Transferir el crecimiento de un tubo de siembra fresco con 2-3 ml de 
agua destilada a una botella Roux conteniendo 250 ml de medio número 8 e incubar a 35 ºC de 18-24 h y después 
a temperatura ambiente por 5 días. 
9.2.4.2. Preparación de placas. 
Añadir 20 ml de medio número 8 a cada caja de Petri, distribuir uniformemente y dejar solidificar (capa base). 
Añadir 5 ml de medio número 8 el cual ha sido inoculado con una suspensión de B. cereus variedad mycoides 
previamente incubada en un baño de agua a 49-50 ºC por 45 min (capa semilla). Llenar los cilindros para la 
determinación de la muestra y curva estándar. Usar la solución amortiguadora pH 4.5 para la preparación de la 
muestra. Incubar a 30 ± 1 ºC. 
9.2.4.3. Solución patrón o madre. 
Disolver aproximadamente 40 mg de estándar pesado exactamente en suficiente HCl 0.01 N para dar una 
solución madre de 1000 µg/ml. La ecuación utilizada para determinar el volumen de solución amortiguadora a 
añadir al estándar de penicilina puede ser utilizada para determinar la cantidad de HCl 0.01 N para ser adicionado 
en este caso punto 9.2.3.3. Almacenar la solución madre en refrigeración por no más de siete días. 
9.2.4.4. Curva estándar o patrón de referencia. 
Diluir la solución madre con suficiente solución amortiguadora pH 4.5 para obtener concentraciones de 0.08, 
0.16, 0.32, 0.64 y 1.28 µg/ml. La concentración de la referencia es de 0.32 µg/ml. Se sugiere el método de dilución 
siguiente: 
De 
(µg/ml)
Tome 
(ml)
Diluya en matraz 
volumétrico
Con. resultante 
(µg/ml)

1000
5.0
50
100.00

100
2.0
50
4.00

4.0
8.0
25
1.28

4.0
4.0
25
0.64

4.0
2.0
25
0.32

4.0
1.0
25
0.16

4.0
1.0
50
0.08

9.2.4.5. Preparación de la muestra. 
Proceder como se describe en el punto 9.2.2., utilizando la cantidad apropiada de solución amortiguadora 
indicada en el "Apéndice A" (Normativo), "Detalle de los métodos de valoración". 
9.2.4.6. Cálculo de la potencia. 
Proceda como se describe en el punto 9.2.1.3. 
9.2.4.7. Organismos indicadores resistentes a la tetraciclina. 
El mismo organismo es utilizado para tetraciclina, clortetraciclina y oxitetraciclina. 
(1) Preparación de suspensión bacteriana.- El organismo de prueba es Staphylococcus epidermidis ATCC 
12228. Mantener, crecer e inocular el organismo de la misma manera como se describe para Sarcina lutea ATCC 
9341a, en el punto 9.2.3., excepto que se debe utilizar medio número 8 en las botellas Roux. 
(2) Preparación de placas.- Utilizar medio número 8 tanto para capa base como semilla, preparar las placas de 
la misma manera como se describe en el punto 9.2.3.2., utilizando la cantidad óptima de suspensión bacteriana, 
usualmente 2-3 ml, para ser añadida a 100 ml de agar. No incubar cultivos en baño de agua como se hace con B. 
cereus. Incubar a 30 ± 1 ºC en incubadora. 
9.2.5. Procedimiento de análisis de clortetraciclina. 
Proceder como para tetraciclina en el punto 9.2.4., usar clortetraciclina como el patrón de referencia. 
9.2.6. Procedimiento de análisis de oxitetraciclina. 
Proceder como para tetraciclina en el punto 9.2.4., usar oxitetraciclina como el patrón de referencia. 
9.2.7. Procedimiento de análisis de estreptomicina. 
9.2.7.1. Preparación de suspensiones bacterianas. 
Utilizar Bacillus subtilis, ATCC 6633 como organismo de prueba. Mantener y crecer los organismos a 35 ± 1 ºC 
de la misma manera como se describe para B. cereus variedad mycoides en el punto 9.2.4.1., utilizando medio 
número 1 con 300 mg de MnSO4H20 por litro de medio. Lavar tres veces el crecimiento de la botella de Roux con 
solución salina por centrifugación y decantación. Reconstituir el sedimento con 50 ml de solución salina y calentar 
la suspensión de esporas por 30 min a 70 ºC. Mantener la suspensión en refrigeración. Determinar la sensibilidad 
óptima como en el punto 9.2.3.1. 
9.2.7.2. Preparación de placas. 
Usar medio número 5 para capa base y semilla, preparar las placas como se describe en el punto 9.2.3.2., 
utilizando la cantidad óptima de suspensión de bacterias para ser añadida a 100 ml de agar e incubar en un baño 
de agua de 49-50 ºC por 75 min. Para análisis de estreptomicina y/o penicilina añadir penicilinasa a la capa 
semilla. Incubar a 30 ± 1 ºC. 
9.2.7.3. Curva estándar o patrón de referencia. 
Secar 30-40 mg de sulfato de estreptomicina estándar, por tres horas a 60 ºC en una estufa de vacío a una 
presión de 5 mm de mercurio o menos. Determinar el peso seco exacto y disolver en suficiente agua destilada para 
dar una solución patrón o madre de 1000 µg/ml. Calcular la cantidad de agua a ser añadida por la fórmula usada 
en el punto 9.2.1.2. Conservar la solución patrón o madre bajo refrigeración por no más de 30 días. Diluir en 
solución amortiguadora pH 8.0 para dar concentraciones de 0.125, 0.25, 0.50, 1.0, 2.0 y 4.0 µg/ml. Utilizar 
únicamente las últimas cinco concentraciones para graficar la línea de respuesta sobre papel semilogarítmico. 
Usar la de 0.125 µg/ml para determinar el nivel bajo de detección. La concentración de referencia es 1.0 µg/ml. Se 
sugiere utilizar el siguiente método de dilución: 
De 
(µg/ml)
Tome 
(ml)
Diluya en matraz 
volumétrico
Conc. resultante 
(µg/ml)

1000
2.5
100
25.000

25
4.0
25
4.000

25
2.0
25
2.000

25
1.0
25
1.000

25
1.0
50
0.500

25
0.5
50
0.250

25
0.5
100
0.125

9.2.7.4. Organismos indicadores resistentes a estreptomicina. 
Utilizar Sarcina lutea ATCC 9341a como organismo de prueba. Tratar de la misma manera como S. lutea en la 
preparación de la suspensión bacteriana para análisis de penicilina indicado en el punto 9.2.3. 
(1) Preparación de la muestra. Proceder como se describe en el punto 9.2.2., utilizar la cantidad apropiada de 
solución amortiguadora indicada en el "Apéndice A" (Normativo), "Detalle de los métodos de valoración". 
(2) Cálculo de potencia. No se requiere cálculo de potencia; usar el organismo como un control indicador de 
resistencia. 
9.2.8. Procedimiento de valoración de eritromicina. 
9.2.8.1. Preparación de la suspensión de esporas. 
Utilizar Sarcina lutea (ATCC 9341a) como organismo de prueba. 
Preparar una suspensión del organismo en la forma descrita bajo valoración de penicilina en el punto 9.2.3. 
Antes del análisis, determinar por ensayo en placas la cantidad óptima (usualmente 0.1-0.5 ml) de la suspensión 
para ser añadida a 100 ml de medio número 11, el cual ha sido fundido y enfriado a 49 ºC. Almacenar la 
suspensión en el refrigerador por no más de dos semanas. 
9.2.8.2. Preparación de placas. 
Añadir 20 ml de medio número 11 a cada caja de Petri. Distribuir uniformemente y dejar solidificar. Añadir 5 ml 
de medio número 11, el cual ha sido inoculado con una suspensión de Sarcina lutea. Proceder como se describe 
para la preparación de placas en el punto de penicilina 9.2.3.2. Incubar a 30 ºC durante 16-18 h. 
9.2.8.3. Curva estándar o patrón de referencia. 
Preparar una solución patrón disolviendo de 30-50 mg de eritromicina estándar en 2 ml de metanol. Añadir 
suficiente solución amortiguadora 0.2 M pH 8.0 para dar una concentración de 1000 µg/ml. Utilizar la fórmula del 
punto 9.2.1.2. Diluir en la solución amortiguadora para obtener concentraciones de 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 y 0.8 
µg/ml. La concentración de referencia es 0.2 µg/ml. Preparar una curva estándar como la descrita en el punto 
9.2.1.2., utilizando las concentraciones antes citadas. 
9.2.8.4. Preparación de la muestra. 
Proceder como se describe en el punto 9.2.2., utilizando la cantidad apropiada de solución amortiguadora 
indicada en el "Apéndice A" (Normativo), "Detalles de los métodos de valoración". 
9.2.8.5. Cálculo de potencia. 
Proceder como se describe en el punto 9.2.1.3. 
9.2.8.6. Organismos indicadores resistentes a eritromicina. 
Tratar el organismo de prueba Sarcina lutea ATCC 15957 de la misma manera como S. lutea ATCC 9341a en 
el punto 9.2.3., utilizar medio número 11 en botellas Roux, capas base y semilla. 
(1) Preparación de la muestra.- Proceder como se describe en el punto 9.2.2., utilizar la cantidad apropiada de 
solución amortiguadora indicada en el "Apéndice A" (Normativo). 
(2) Cálculo de potencia.- S. lutea ATCC 15957 es resistente a eritromicina, no se requiere ningún cálculo de la 
potencia. Utilizar el organismo como un control indicador de resistencia. 
9.2.9. Procedimiento de valoración de neomicina. 
9.2.9.1. Preparación de suspensiones bacterianas. 
Utilizar Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228) como organismo de prueba, manteniéndolo como solución 
stock sobre agar inclinado de medio número 1. Transferir el crecimiento del agar inclinado fresco con 2 ml de 
solución salina fisiológica estéril a una botella de Roux conteniendo 250 ml de medio número 1 e incubar de 18 - 
24 h a 35 ± 1 ºC. 
Recolectar el crecimiento de la superficie de agar con 50 ml de solución salina estéril. Determinar la suspensión 
a utilizarse (usualmente 1:25) que dé 25% de transmitancia. Antes del ensayo determinar por placas de prueba, la 
cantidad óptima (usualmente 1.0-2.0 ml) de la dilución de la suspensión a ser añadida a 100 ml de medio número 
11, el cual ha sido fundido y enfriado a 49 ºC. Almacenar la suspensión en el refrigerador por no más de una 
semana. 
9.2.9.2. Preparación de las placas. 
Añadir 20 ml de medio número 11 a cada caja de Petri, distribuir uniformemente y dejar solidificar. 
Añadir 5 ml de medio número 11 previamente inoculado con una suspensión de Staphylococcus epidermidis. 
Proceder como se describe para la preparación de placas para penicilina en el punto 9.2.3.2. Incubar a 35 ± 1 ºC 
de 16-18 h. 
9.2.9.3. Curva estándar o patrón de referencia. 
Disolver el peso del estándar de trabajo en solución amortiguadora de fosfato de potasio 0.2 M pH 8.0. Para 
tener una solución patrón de 1000 µg/ml. Almacenar por no más de 14 días en el refrigerador. Diluir la solución 
patrón de neomicina en solución amortiguadora pH 8.0 para tener concentraciones finales de 0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 
2.0, 4.0 µg/ml. La concentración 1.0 µg/ml es la de referencia. 
9.2.9.4. Preparación de muestras. 
Proceder como se describe en el punto 9.2.2., utilizando la cantidad apropiada de solución amortiguadora 
indicada en el "Apéndice A" (Normativo). 
9.2.9.5. Cálculo de potencia y experimentos de recuperación. 
Proceder como se describe en el punto 9.2.1.3. 
10. Resultados 
10.1. Interpretación de resultados. 
Las muestras positivas son aquellas donde el halo de inhibición se forma alrededor de la torunda o hisopo. En 
caso de desear cuantificar la cantidad y tipo(s) de antibiótico(s) es necesario realizar el bioensayo en donde el 
resultado será la cantidad encontrada después de medir los halos de inhibición e interpolar el valor en la curva de 
referencia, multiplicado ese dato por el factor apropiado de dilución, indicado en el "Apéndice A" (Normativo). 
10.2. Informe de resultados. 
Se reportarán como positivos o negativos en el caso de la prueba de la torunda y para bioensayo en ppm del 
antibiótico(s) encontrado(s). 
11. Sanciones 
El incumplimiento a las disposiciones contenidas en la presente Norma, será sancionado conforme a lo 
establecido en la Ley Federal de Sanidad Animal y la Ley Federal sobre Metrología y Normalización. 
12. Concordancia con normas internacionales 
Esta Norma Oficial Mexicana no es equivalente con ninguna norma internacional. 
13. Bibliografía 
Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, 5a. Edición. México, 1988. 
Manual para la Determinación Cualitativa de Antibióticos en Muestras de Carne (prueba de la torunda). Centro 
Nacional de Servicios de Constatación en Salud Animal, DGSA, SARH, 1994. 
Manual para determinación de Residuos de Antibióticos en Tejido Animal. Centro Nacional de Servicios de 
Constatación en Salud Animal, DGSA, SARH, 1994. 
Microbiology Laboratory Guidebook. United States Department Agriculture. Food Safety and Inspection Service, 
1977. 
14. Disposiciones transitorias 
Esta Norma entrará en vigor al día siguiente de su publicación en el Diario Oficial de la Federación. 
Sufragio Efectivo. No Reelección. 
México, D.F., a 31 de enero de 1996.- El Director General Jurídico, Roberto Zavala Echavarría.- Rúbrica. 
"APENDICE A" (NORMATIVO) DETALLES DE LOS METODOS DE VALORACION 
 Antibióticos
Diluciones de 
la muestra
 Diluente
Factor de 
dilución
Concentraciones finales 
para curva estándar

Penicilina
1+4
Solución amortiguadora al 
1% pH 6.0
5
0.0063, 0.0125, 0.025, 
0.05, 0.10, µg/ml

Clortetraciclina
1+4
Solución amortiguadora 
0.01 M, pH 4.5
5
0.08, 0.16, 0.32, 0.64, 1.28, 
µg/ml

Tetracilcina o 
Oxitetracilcina
1+4
Solución amortiguadora 
0.1 M, pH 4.5
5
0.08, 0.16, 0.32, 0.64, 1.28, 
µg/ml

Estreptomicina
1+4
Solución amortiguadora 
0.1 M, pH 8.0
5
0.125, 0.25, 0.5, 1.0 y 2.0, 
µg/ml

Neomicina
1+4
Solución amortiguadora 
0.2 M, pH 8.0
5
0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 
µg/ml

Eritromicina
1+4
Metanol y Solución 
amortiguadora 
0.2 M, pH 8.0
5
0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 
µg/ml

(a)	La concentración subrayada es la concentración de referencia. 
"APENDICE B" (NORMATIVO) PRUEBAS CONTROLADAS DE ANTIBIOTICOS (Curva Estándar) 
	FECHA	 
ANTIBIOTICO____________	TEJIDO	 
CONCENTRACION	Puntos alto y bajo para la gráfica: µg/ml		Punto bajo: L = (3a + 2b + 
c - e)/5 a = ______	d = ______	Punto alto: H = (3e + 2d + c - a)/5 b = ______	e = 
______ c = ______ Ref.	 

(a)
Ref.
(b)
Ref.
(d)
Ref.
(e)
Ref.

Diámetro de la zona	 -1-









ZONA I	 -2-









	-3-









Diámetro de la zona	 -1-









ZONA II	 -2-









	-3-









Diámetro de la zona	 -1-









ZONA III	 -2-









	-3-









Suma de Placas









Promedio de placas









Factor de corrección









Promedios corregidos









Sumatoria de zonas de referencia	 
Promedio de zonas de referencia	 Analista(s):